神经元特异性烯醇化酶（NSE）酶联免疫分析试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供体外研究使用

产品货号：L5E1008                                          

预期应用

ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中神经元特异性烯醇化酶（NSE）的浓度，适用于胰腺，肝胆和胃癌患者的早期诊断，治疗的监测和监测癌症的复发。

概述

神经元特异性烯醇化酶（NSE）：小细胞肺癌（SCLC）的首选标志物。NSE对小细胞肺癌的检出率为70%-80%。神经内分泌肿瘤、神经母细胞瘤、APUD系统肿瘤均可升高。NSE还可用于病情监测，肺癌患者在病情恶化时会升高，且其值升高要比临床检出的复发早4～12周。标本溶血或血清在离心前放置时间过长都会引起测定值升高；中枢神经系统损伤也会升高。

实验原理

用纯化的NSE抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗NSE抗体的微孔中依次加入标本或标准品、HRP标记的抗NSE抗体，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的NSE含量呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制

1.         酶联板：一块（96孔）

2.         标准品：6瓶，0.5ml/瓶。NSE浓度分别为0 ng/ml ，5 ng/ml，20 ng/ml，80 ng/ml，160 ng/ml，320ng/ml。

3.         HRP标记的抗NSE抗体：1×10ml/瓶。

4.         TMB显色液：1×10ml/瓶。

5.         浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释20倍。

6.         终止液：1×5ml/瓶（2N H₂SO4）。

标本的采集及保存

1.         血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于5000 x g离心5分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.         血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 5000 x g离心5分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.         细胞培养物上清或其它生物标本：请5000 x g离心5分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

注：以上标本置4℃保存应小于1周，-20℃或-80℃均应密封保存，-20℃不应超过3个月，-80℃不应超过6个月；标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测；高血脂的标本不需进行特殊处理，可直接检测。

操作步骤

1.         加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液40ul，余孔分别加标准品或待测样品40ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应30分钟。

为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.         弃去液体，洗涤五次，拍干。每孔加HRP标记的抗NSE抗体工作液100ul，37℃,30分钟。

3.         温育后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，拍干。

4.         每孔加显色工作液100ul，37℃避光显色，10分钟。

5.         依序每孔加终止溶液50ul，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

6.         用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止液后立即进行检测。

注：

1.         每次实验留一孔作为空白调零孔（不同于空白孔），该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液即显色液及2N H₂SO4。测量时先用此孔调OD值至零。

2.         严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室 温。使用后立即冷藏保存试剂。

3.         洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入HRP标记抗体溶液或底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜，洗板拍干后请立即加入后步试剂，应避免微孔干燥掉。

4.         消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

5.         在储存和温育时避免强光直接照射。

6.         未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。HRP标记抗体工作液、显色液工作液请依据所需的量配置使用。标准品需要重复使用时，请按需要量分装，于-20度冰箱保存。请勿重复使用HRP标记抗体工作液、显色液工作液等。

7.         建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水

纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需

要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

特异性

    本试剂盒可同时检测重组或天然的神经元特异性烯醇化酶（NSE）。

计算

  以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线（推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert 1.3），根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项

1.         洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。

2.         一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用多道移液器加样。

3.         请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。

4.         如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。

5.         在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。

6.         底物请避光保存。

检测范围：5ng/ml –320ng/ml

最低检测限：0.5ng/ml

说明

1.         只有全部使用LINC-BIO试剂才能保证检测效果，因为所有试剂都是有关联的，不能混用其他制造商的产品。只有严格遵守LINC-BIO试剂的试验说明才会得到最佳的检测结果。

2.         在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。

3.         小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本/标准品，酶结合物或底物时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。而且，洗涤不充分将影响试验结果。

4.         试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时，仅适用于部分试剂，具体见标签）；2-8℃（频繁使用时）。

5.         浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

6.         刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。

7.         所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。

8.         有效期：6个月。

特别说明:本试剂盒仅供科学研究用.