产品简介

本试剂盒是利用拓扑异构酶（Topoisomerase）高效快速连接DNA片段的原理进一步研发而成，与传统的T4连接酶相比，具有以下优势：1）快速，仅需1-5分钟即可完成连接反应。2）高效，无自连现象，阳性克隆率接近100%，无需设置蓝白斑筛选；3）操作简单，从连接到涂板仅需15-20 min。操作过程省去冰浴、热激和1 h复苏等。4）可连接长达5 kb目的产物。

用于平末端PCR产物的快速克隆；克隆后PCR产物的快速测序（使用M13F/M13R引物）。

产品信息

组分信息

储存条件

-25~-15℃保存，有效期1年。

使用说明

1. Control DNA 片段的克隆实验

​​​​​​​1）在无菌微量离心管中配制下列DNA溶液，以10 μL为例。

2）混匀上述体系。于室温（20-30℃）反应5 min。

*连接反应不可于冰上进行。反应时间不要超过5 min，一般1-2 min即可完成连接反应，得到足够的重组子。

3）连接产物可直接转化或于-20℃保存。

4）全量10 μL加入100 μL感受态细胞，轻轻混匀，室温放置5 min。

*也可取5 μL连接液，加入50 μL感受态细胞中（加入体积不超过感受态细胞体积的1/10）。

**通常使用商品化的感受态细胞不需要冰浴和热休克、室温放置5 min便可获得足够多转化子，如果感受态细胞效率较低时，可以按照冰浴热激的标准程序进行。

5）加300-500 μL LB或者SOC培养基（不含抗生素），37℃ 180 rpm振荡培养10 min。

 6）取200 μL菌液涂板（含氨苄抗性的LB或SOC固体培养基），培养过夜（如果预计转化子少，为得到较多克隆，4,000 rpm 离心1 min，吸弃掉部分上清，保留100 μL，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板）。

2. 一般DNA片段的克隆实验

所插入片段为平末端产物，利用高保真DNA聚合酶（Yeasen，Cat#10164ES）扩增得到的产物如无非特异性条带、引物二聚体可直接进行连接反应。

否则建议胶回收后使用。

*PCR产物不能磷酸化。

**如扩增模板为质粒，模板质粒会在后续实验中引起假阳性，因此推荐PCR产物进行胶回收后连接。

1）按照下表配制连接体系（以10 μL为例）

*可根据具体实验情况按照上述比例调整反应体系。

**不同的插入片段所用量参考下表：

2）混匀上述体系。于室温（20-30℃）反应5 min。

*连接反应不可于冰上进行。反应时间不要超过5 min，一般1-2 min即可完成连接反应，得到足够的重组子。

3）全量10 μL加入100 μL感受态细胞，轻轻混匀，室温放置5 min。

*也可取5 μL连接液，加入50 μL感受态细胞中（加入体积不超过感受态细胞体积的1/10)。

**通常使用商品化的感受态细胞不需要冰浴和热休克、室温放置5 min便可获得足够多转化子，如果感受态细胞效率较低时，可以按照冰浴热激的标准程序进行。

4）加300-500 μL LB或者SOC培养基（不含抗生素），37℃ 180 rpm振荡培养10 min。

*通常商品化的感受态细胞不超过2 kb插入片段情况下，10 min复苏可以得到足够多转化子，如果感受态效率低或者插入片段长转化子少的情况下可以提高复苏时间到30-60 min以得到更多的转化子。

5）取200 μL菌液涂板（含氨苄抗性的LB或SOC固体培养基），培养过夜（如果预计转化子少，为得到较多克隆，4,000 rpm 离心1 min，吸弃掉部分上清，保留100 μL，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板）。

6）转化子的筛选鉴定

a. 菌落/菌液PCR鉴定，用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至菌落PCR Mix中混匀（如：2×Hieff^® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)，Cat#10157ES），加入引物直接进行PCR反应。

b. 质粒大小鉴定：挑取单克隆，抽提质粒后可根据质粒大小进行鉴定。

c. 酶切鉴定：根据克隆实验设计，选择合适的限制性内切酶进行鉴定。
d. 测序分析：可选测序引物序列如下：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：CAGGAAACAGCTATGACC

*本制品阳性率相当高，一般情况下，阳性克隆率接近100%，只要是长出来的菌落正常（不是污染的杂菌，转化子数量也不算太少），基本就是阳性克隆，因此插入片段不超过2-3 kb的情况下可以不用鉴定直接挑1-2个菌去测序。

载体图谱

pESI-blunt vector sequence

ORIGIN

        1 cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct

       61 gctgaagcca gttacctcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc

      121 gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct

      181 caagaagatc ctttgatttt ctaccgaaga aaggcccacc cgtgaaggtg agccagtgag

      241 ttgattgtgt aaaacgacgg ccagtgtctg aggctcgctg cagtcctgaa gcttgatatc

      301 gaattcgcgt gtcgccctta agggcgacac gcgaattcga tatcgcggcc gcctgcagtc

      361 aatactgacg atggtcatag ctgtttcctg tccatagcag aaagtcaaaa gcctccgacc

      421 ggaggctttt gacttgatcg gcacgtaaga ggttccaact ttcaccataa tgaaataaga

      481 tcactaccgg gcgtattttt tgagttatcg agattttcag gagctaagga agctaaaatg

      541 agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt

      601 tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga

      661 gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa

      721 gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt

      781 attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt

      841 gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc

      901 agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga

      961 ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat

     1021 cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct

     1081 gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc

     1141 cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg

     1201 gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc

     1261 ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg

     1321 acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca

     1381 ctgattaagc attggtaatg agggcccaaa tgtaatcacc tggctcacct tcgggtgggc

     1441 ctttctgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat

     1501 cgatgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc

     1561 cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc

     1621 gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt

     1681 tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac

     1741 cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg

     1801 ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca

     1861 gagtt

//

*黄底为多克隆酶切位点序列

注意事项

​​​​​​​1.需自备的材料：

1）自备试剂（仅罗列部分）：

1. 超级感受态：转化效率＞10⁸ cfu/μg，如翌圣DH5α超级感受态细胞（Cat#11802ES）。
2. 高保真酶：2× Hieff Canace^® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye)（Cat#10164ES）或其他等效产品。
3. 菌落PCR mix：2× Hieff^® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)（Cat#10157ES）或其他等效产品。
4. 核酸染料：YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000× in Water)（Cat#10202ES）或其他等效产品。

​​​​​​​2）自备仪器耗材（仅罗列部分）：PCR仪，水平电泳槽，切胶仪，EP管等。

2.为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3.本产品仅作科研用途！

Ver.CN20230918