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掌握这几个影响因素,你的反转录实验就完美了

作者:翌圣生物科技(上海)股份有限公司 2020-03-24T00:00 (访问量:8145)

 掌握这几个影响因素,你的转录实验就完美了

小翊君前几期一直在和大家聊qPCR今天我们开启一个新的话题聊一聊转录

反转录(reverse transcription)定义:

反转录过程简单来说是以RNA为模板合成DNA的过程是对中心法则的重要修正和补充。


中心法则

通常会出现两个不同的表述逆转录和反转录,二者的本质区别在于:反转录是在研究过程中人为提取RNA并以之为模板人工合成DNA的过程逆转录是RNA病毒自主行为RNA为模板形成DNA的过程前者发生在体外后者发生在体内。反转录反应的示意图如下图所示:


反转录实验过程

看似简单的反转录实验,但也受到多种因素的影响,如模板、引物、酶以及反应条件等。接下来小编将带您对其各个击破。

一、模板

① RNA身结构(高GC复杂二级结构

RNA由于自身序列折叠,具有不同复杂的二级结构:配对的双链RNA呈螺旋发卡环突环内环多分支环等结构由于配对碱基不同其配对的稳性也不同G与C之间的配对,三对氢键,最为稳定。A与U为两对氢键相互作用;G与U为一对氢键相互作用,最不稳定。故对于RNA模板来讲GC含量越高二级结构越为复杂

在进行反转录的过程中,如下图所示,当引物延伸到有二级结构的地方,反应就会被迫终止,影响cDNA的合成长度。此时可建议先将模板进行65℃孵育5min然后迅速冰上冷却使二级结构变性;同时可通过在较高的温度下(如55℃)反应以降低RNA二级结构的形成


反转录实验延伸过程

② 纯度和浓度的测定

RNA纯度会很大程度影响反转录实验RNA纯化过程中混入的盐金属离子乙醇苯酚等均是常见的转录酶抑制剂此外植物组织中的多糖多酚和腐殖酸等也会对逆转录酶造成抑制作用

对于RNA纯度的测定通常会选用Nano drop进行测定。纯度完好的RNA:1.8<OD260/OD280<2.0(<1.8时表明有蛋白质或酚污染可增加酚抽提;>2.0时表明可能有异硫*酸残存)OD260/OD230应大于2。(<2表明有异硫*酸胍,β-巯基乙醇或乙醇的残留;可进行再次沉淀,重复乙醇洗涤)。

对于RNA浓度的测定通常也会选用Nano drop进行测定

③ 完整度

RNA的完整度在很大程度上影响着cDNA合成的长度与质量。在进行RNA提取处理储存和实验过程中需要采取特殊的保护措施,如操作者佩戴手套和口罩,全程使用无RNA酶污染的实验耗材等

对于下游的克隆实验,RNA完度将会影响cDNA的合成长度,从而影响目的基因的合成。对于下游的目的基因定量实验,将会严重影响其CT值,从而影响定量结果精准度(见下图)。


RNA RIN值和CT值的关系

RNA的完整度通常会通过琼脂糖凝胶电泳进行检测,对于28S和18S rRNA的比值来评估RNA的完整度,接近2:1为较为完整的RNA

目前,Agilent 2100生物分析仪已逐渐成为RNA样品质量控制QC)的行业标准,在分析RNA完整性之后给出准确的数值RIN值),该值在8-10之间表示RNA质量非常好小于7时表示RNA完整度较差

④ gDNA的去除

在进行下游qPCR实验过程中Totol RNA中混入的gDNA可直接作为PCR反应的模板进行扩增造成实验结果的假阳性因此在反转录之前必须要对RNA模板进行去gDNA处理保证模板中仅有cDNA

那么如何解决呢?

我们可通过加入DNaseⅠ去除gDNA。但是在反转录实验前需将DNaseⅠ灭活(通过高温加热或加入EDTA),否则该酶会将cDNA降解,但是高温灭活DNaseⅠ会造成RNA的降解和损失加入EDTA灭活又会引入新的RNA酶抑制剂

Yeasen生物提供的反转录试剂盒含gDNA digester组分在反转录之前可将其与RNA模板混匀42℃2min即可去除gDNA组分同时试剂盒中的SuperMix 可终止gDNA digester的作用,保证cDNA的完整性

二、引物

① Oligo(dT)

Oligo(dT)引物是12-18个多聚胸腺嘧啶T组成的重复寡核苷酸序列,能够特异性地与真核生物mRNA的ploy(A)尾退火,故不适合缺少ploy(A)尾结构的RNA如原核生物RNA或microRNA,也不适用于已降解的RNAFFPE样品中RNA

真核生物中mRNA仅占总RNA的1%-5%左右,通常在进行从真核生物中构建cDNA文库或者克隆全长cDNA以及3’RACE等研究时会优先选择 Oligo(dT)引物

对于复杂模板RNA如含较多二级结构,在进行cDNA的合成延伸过程中当延伸到二级结构处时可能会造成延伸终止,若选择Oligo(dT)可能会造成mRNA 5’端信息的丢失。

② Random N6-N9

随机引物是由随机碱基组成的寡核苷酸通常由6个核苷酸组成,称为随机6聚体。该种引物不具备特异性,rRNA, tRNA,非编码RNARNA降解RNA复杂二级结构的RNA等都可以作为其模板该类引物可提高cDNA的产量和浓度,但是会使合成的cDNA度变短

③ 基因特异性引物

基因特异性引物能够与模板特异性互补,产生目标性很强的cDNA对于后续的PCR扩增更特异适用于已知目的序列通常应用于一步RT-PCR反应当使用基因特异性引物GSP)无法有效合成第一链cDNA时可选用Oligo(dT)或随机引物。

三、酶

不同的逆转录酶具有不同的功能活性,表现出不同的逆转录效率,如合成cDNA的长度,产量,对复杂模板的适应程度等。通常共有的活性如下:

1)RNA指导的DNA聚合酶活性RNA为模板催化dNTP聚合形成DNA的过程

2)RNaseH活性在反应过程中切割RNA:cDNA杂合链中的RNA模板。降低此活性,可避免在合成较长cDNA之前模板RNA被降解掉

3)DNA指导的DNA聚合酶活性以反转录合成的第一条cDNA单链为模板再合成第二条cDNA分子

4)热稳定性:此性能是影响cDNA合成的重要因素升高反转录过程中的温度有助于高GC或复杂二级结构RNA模板的变性实现全长cDNA的合成

5)保真性:RNA反转录为cDNA过程中的序列精确度由于逆转录酶不具备3’-5’外切酶活性,因此没有校正功能,所以合成的cDNA出错率较高。通常,除测序对精准度要求较高外,其他情况下,反转录中引入的错误数量可忽略不计,因为cDNA中的错误不会被放大

6抗抑制能力当模板纯度较低、抑制物较多时,抗抑制能力强的逆转录酶才能正常进行cDNA的合成

目前使用的逆转录酶大都为MMLV(来源于莫洛尼鼠白血病病毒)。未经改造的MMLV最适反应温度为37℃有较低的RNaseH活性Yeasen生物对MMLV反转录酶进行改造,提高其最适反应温度(高温下有利于RNA二级结构的打开),降低RNaseH活性提高cDNA合成长度增强其灵敏度和耐抑制能力改造结果见下图


逆转录酶的改造

各种逆转录酶的性能参数如下表

项目

酶类

AMV逆转录酶

MMLV逆转录酶

Yeasen逆转录酶

RNaseH

反应温度

42℃

37℃

55℃

反应时间

60min

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