Fig.1 SARS-CoV-2病毒种类及分布，红色为亲和力增强型毒株；

黄色突变毒株亲和力与原型毒株无明显差异

由于RBD是结合人ACE2并启动细胞进入的唯一结构域，通常认为RBD应高度保守。但是多态性和差异性分析表明，与S蛋白的其他区域类似，RBD序列也呈现多样性^[3]。

已公布基因组序列的1609个SARS-CoV-2毒株中，经多态性分析发现有32个毒株在RBD中含有氨基酸突变。这些毒株来自多个地区，包括中国，英国，芬兰，法国，比利时，美国和印度。大多数突变体与最先发现的基因组（SARS-CoV-2 WuHan-Hu-1）相比，仅相差一个氨基酸。进一步分析得出32个RBD突变型分为10种类型（Fig. 1）^[3]。

利用分子动力学模拟分析比较原型毒株SARS-CoV-2（SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1）RBD蛋白和突变型毒株的RBD蛋白与人ACE2的结合能力。分析结果显示与原型毒株RBD蛋白相比，三个RBD突变蛋白（N354D&D364Y，V367F，W436R）的ΔG均为-200 kJ / mol，比原型毒株低约25%，与人ACE-2的亲和力显著提高^[3]。

RBD与ACE2的结合界面主要是无规卷曲构象，因而缺乏结构上的刚性。通过增加骨架的刚性可以维持相互作用表面的结合构象，从而提高亲和力。以残基510-524为中心的β折叠结构就起到了这种支架的作用，该区域附近的突变体N354D，D364Y，V367F和W436R在结构上增加了刚性作用，同时这些突变位点导致结合位点区域的ΔG总体降低，增加了结构的稳定性，这些因素共同导致了突变体RBD与ACE2亲和力的提高。

另外，ACE2表面附近带大量负电荷，而突变体W436R提供了带正电的氨基酸。这种潜在的静电作用力可能有助于亲和力的提高。

Fig. 2 RBD突变体的结构分析及其结合亲和力的影响：

突变氨基酸和片段510-524的空间位置

ACROBiosystems SARS-CoV-2 RBD突变蛋白验证ELISA Binding Assay结果显示，所有RBD突变蛋白与人ACE2受体蛋白结合活性均高于原型毒株RBD蛋白, RBD (V367F) EC50: 0.31nM > RBD (W436R) EC50: 0.89nM > RBD (N354D, D364Y) EC50: 0.97nM > 原型毒株RBD EC50: 1.47nM (Fig. 3)。

Fig. 3 Human ACE2与 SARS-CoV-2 RBD蛋白结合活性ELISA比较

BLI验证发现，突变蛋白 RBD(V367F)，RBD (W436R)和RBD (N354D, D364Y) 与ACE2的亲和力均达到nM水平, KD值分别为5.5nM, 6.85nM和6.32nM，比原型毒株RBD与ACE2 受体蛋白亲和力（24.4nM）高3倍以上（Fig. 4）。

Fig. 4 BLI技术验证Human ACE2与 SARS-CoV-2 RBD蛋白亲和力

与BLI检测结果类似，SPR原型毒株RBD与人ACE2受体蛋白亲和力为13.1nM，突变蛋白RBD(V367F)，RBD (W436R) 和RBD (N354D, D364Y)的KD值分别为4.33nM、6.96nM和7.57nM（Fig. 5）。

Fig. 5 SPR技术验证Human ACE2与 SARS-CoV-2 RBD蛋白亲和力